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知名化妆品企业3D皮肤模型

 
       在讲皮肤模型之前,先了解下正常人皮肤的结构。
       皮肤是人体的第一道防御屏障,覆盖全身,它使体内各种组织和器官免受物理性、机械性、化学性和病原微生物性的侵袭。皮肤重量约为体重的16%,成人皮肤总面积为1.5~2.0平方米,厚度因年龄、性别、职业以及部位的不同会所区别(0.5~4.0 mm)。皮肤由表皮、真皮和皮下组织三大部分组成。
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       (1)表皮
       皮肤最外面的一层是表皮,主要起屏障作用。
       表皮中的角质细胞,根据细胞的不同发展阶段和形态特点,由外向内可分为5层,分别为角质层、透明层(仅掌,趾处有)、颗粒层、棘层和基底层。
       其最内的基底层及及最外的角质层对于表皮的结构有着非常重要的作用。基底层由一层排列呈栅状的圆柱细胞组成,此层细胞不断分裂,逐渐向上推移,变形,形成表皮其他各层。角质层其内细胞已死亡,无细胞核和其它细胞结构,增强了表皮的物理强度。与皮肤模型最相关的就是基底层和角质层。
       (2)真皮
       真皮位于表皮下,紧邻表皮的为真皮乳头层,其下层称真皮网状层。真皮结缔组织主要由胶原纤维、弹性纤维和网状纤维组成。
       成纤维细胞(Fb)是结缔组织中的主要细胞,产生和维持了大部分的细胞外基质,弹性纤维、蛋白多糖和糖蛋白散布于胶原纤维之间。真皮赋予皮肤强度、柔韧性和弹性,并影响着伤口收缩和愈合时瘢痕的形成。
       (3)皮下组织
       皮下组织属于间叶组织,由真皮下部延续而来,由疏松的结缔组织及脂肪小叶构成。脂肪细胞为其中的主要细胞。此外,皮下组织内尚分布有淋巴管、神经、汗腺体以及毛囊(乳头部)。

       皮肤模型实际上就是体外模拟上面所说的这些正常皮肤的结构,模拟真皮、模拟表皮或者模拟真表皮全层,由于模拟皮下组织中的毛囊,汗腺,神经等都非常有难度,所以目前皮肤模型多集中在于模拟真表皮结构。
       皮肤模型的构建属于皮肤组织工程范畴,是组织工程和再生医学的重要组成部分,具体来说就是应用细胞生物学和工程学的技术和原理,设计构建和培养生物活性的皮肤组织替代物,以用于修复或重建皮肤组织或体外研究其功能。皮肤模型的研究也从体内研究(即临床医学)扩展到体外研究(分析检测),体外研究是指外来化学物质作为受试品通过皮肤模型,考察对皮肤刺激和腐蚀的急慢性反应等安全性评估或皮肤功能方面的功效性评估。

       到目前为止,商业化和即将商业化皮肤组织检测模型已达30余种。众多模型当中,注册商业皮肤用于检测的研发机构以美国居多。而化妆品企业自有的皮肤模型有:欧莱雅(L'Oréal)的 EpiSkin®, SkinEthic®和汉高(Henkel)的Phenion®。
     1. EpiSkin®
       Episkin®是法国欧莱雅旗下子公司Episkin中心的体外重建的表皮模型,类似于人的表皮层,Episkin®最早是于1991年由Imedex公司的Estelle Tinois-Tessonneaud等人构建的(Estelle Tinois 现欧莱雅Episkin总监),后欧莱雅收购Imedex,EpiSkin®皮肤模型正式成为其旗下。 
       EpiSkin®构建
       EpiSkin®是以人胶原I 和胶原III 冷冻干燥并交联形成多孔性的材料做底部基质支架(孔径为50~100 um),然后在其上涂布一层人胶原IV,干燥后形成IV胶原的薄膜(10~20 um厚),使用饲养层培养(Green’s technique,1975)人正常角质细胞(NHEK, Normal human epidermal keratinocyte),并将其接种到覆有IV型胶原的支架上,经过13天的浸没及气液相培养形成的一种类似人表皮的成熟的具有分层分化结构的体外重建表皮模型。
       EpiSkin®应用
       EpiSkin®模型可以对模型切片进行组织化学分析,对培养基进行细胞因子,炎症因子方面的分析,同时通过提取DNA或RNA也可进行基因组方面分析。EpiSkin®模型作为表皮替代物,在化妆品领域内可用于透皮吸收分析,皮肤腐蚀性,皮肤刺激性分析,光毒性分析,UVA/UVB暴露及保护分析。其中最主要的并且也是最早被ECVAM验证通过的可以作为化妆品动物替代实验的就是体外皮肤腐蚀性测试(OECD TG431)和体外皮肤刺激性实验(OECD TG439)。

      2. SkinEthic®
       SkinEthic®模型最早于1990年由Rodsy M, Clauss LC 等人构建,原属于位于法国尼斯的组织工程业的领导企业SkinEthic公司所有,后SkinEthic于2006年被欧莱雅旗下Episkin公司收购,正式归入其旗下。
       SkinEthic®构建
       SkinEthic®体外重建表皮模型(Reconstructed Human Epidermis, RHE)是用具有聚碳酸酯膜的Transwell(Costar)作为支架,使用化学限定培养基(即无血清培养基,1990年使用的是MCDB 153培养基,相对于Episkin®的Green’s技术是有血清的培养基)培养人角质细胞NHEK,并将消化下来的角质细胞接种到聚碳酸酯膜上,依次经历低钙(0.15 mM)及高钙(1.15 mM)浓度,气液相培养17天,形成完全分化的表皮结构。
       SkinEthic®产品的质量控制,包括组织学观察和组织活性测定(MTT试验)要求有呈现较好分化状态的表皮层,具有基底层、棘层、颗粒层及角化层,且至少有4层活细胞层,没有明显的组织学畸形;组织活性OD值>0.7。
        除体外重建表皮模型外,后续SkinEthic®又拓展将角质细胞与人黑色素细胞一起接种到聚碳酸酯膜上形成体外重建色素化表皮模型(Recontructed Human Pigmented Epidermis, RHPE)。 
       SkinEthic®应用
       SkinEthic®模型同样可进行形态学的组化分析,培养基中细胞因子,炎症因子等水平检测及基因方面的分析,相较于 Episkin®模型其优势在于使用化学限定培养基培养与有血清培养基相比,培养基中各成分组成及浓度都是确定的,有利于机理表达通路等研究某些特定因子上调或下调(血清成分相当复杂,各批次血清间也存在差异,会影响机理及通路的判断)。作为表皮替代物,在化妆品领域内可用于透皮吸收分析、皮肤腐蚀性(OECD TG431)、皮肤刺激性分析(OECD TG439,42bis)、皮肤致敏性、光毒性分析、UVA/UVB暴露及保护分析、美白/美黑作用分析。
    
       3. Phenion®
       Phenion®模型是汉高(Henkel)与法兰克福的Johann WoKgang Goethe大学以及一群教授通过公私合营方式经营的生物技术研究公司Phenion GmbH and Co. KG 研发的。Phenion公司在2001年底就开始专门研究分子细胞生物学,重点在皮肤细胞生物学以及如何受个人护理品中活性组分的影响。汉高提供资金及管理。2007年,Phenion的K.R.Mewes及M.Raus等研发出一种不仅具有表皮层还有真皮层结构的体外重建全层皮肤模型,Phenion®模型。2009年1月,一直以一个独立部门在汉高化妆品/盥洗品业务的研发部门内运作的公司Phenion GmbH,成为了汉高集团的一部分。
       Phenion®构建
       Phenion®体外重建全层皮肤模型(Phenion® Full Thickness Skin Model)与episkin®及skinethic®不同的是,它不仅仅是表皮模型,phenion®还含有真皮层。Phenion®模型使用牛胶原作为基质支架,具体来说是将冻干的牛跟腱胶原(sigma)酸化溶胀形成半黏性的胶原悬液,然后再将这种胶原悬液浇注到24孔板中冷冻干燥形成胶原支架,并进一步使用戊二醛进行交联,交联后的胶原支架便可用来进行培养,之后将人真皮的成纤维细胞接种到支架上培养2周,形成模型的真皮层,然后在接种人表皮的角质细胞在真皮层上,经过1周浸没培养和2周气液相培养而最终形成具有功能性真皮层且有分化分层结构表皮层的全层皮肤模型(5周培养时间)。
       Phenion® 应用
        Phenion®模型因为含有真皮层,相对于表皮模型EpiSkin®及skinethic®侧重于化妆品安全性方面的应用,Phenion®的优势在于化妆品功效性方面的研究,由于含有真皮层可以研究由于年龄或环境因素引起的皮肤衰老(通过检测真皮中弹性蛋白elastin,原纤蛋白fibrillin-1,各类胶原的表达)并对化妆品的这方面功效进行评价,同时因为既有真皮层又有表皮层,因为具有真表皮间细胞的相互影响及作用,能更好的研究紫外照射,污染或其他条件对皮肤的影响及皮肤机理方面的研究。可用于化妆品活性成分/终产品安全性及功效性评价(抗衰老,美白,抗氧化,愈伤再生等)、真表皮分化研究、皮肤机理研究以及一些基因学测试。

       总的来说,EpiSkin®和SkinEthic®属于表皮模型,侧重于化妆品安全性(因为安全性主要评估对表皮屏障的影响以及透过表皮层的一些参数),培养周期短,商业化应用前景大,也可以做一些功效测试及评估,但仅限于表皮层的功效。
       其中,EpiSkin® 具有厚的成熟的角化层,使用含血清培养技术培养表皮更接近于正常皮肤表皮层,但血清会为测试带来一定干扰。
       SkinEthic®使用化学限定培养基培养表皮,各成分明确清晰,有助于分析检测,但此种培养方式有存在组织学畸形的风险。
       Phenion®属于真表皮全层皮肤模型,具有含Fb的活的真皮层,能模拟正常皮肤的真皮层,也能测试真表皮的交互影响,侧重于化妆品功效性评估,可进行真皮、表皮及真表皮相互作用的功效及机理研究,但培养周期长,技术相对复杂;也可用于安全性的检测,但有“大材小用”之嫌,没有直接用表皮模型方便。
   

参考来源
1. Experimental Cell Research, 1991, 193: 310-319
2. Journal of Investigative Dermatology, 1990, 95: 409-414
3. Skin Pharmacol Physiol, 2007, 20:85-95
4. http://www.episkin.com
5. http://www.henkel.com
6. https://eurl-ecvam.jrc.ec.europa.eu/
本文来源于理妍工坊。

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